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用于牙周炎源性骨缺損修復的3D打印生物墨水

更新時(shí)間：2024-02-18點(diǎn)擊次數：702

牙周病是被世界衛生組織認定為危害人類(lèi)健康的三大疾病之一?；謴脱乐苎滓鸬墓菃适潜苊庋例X松動(dòng)脫落的關(guān)鍵步驟之一。然而，由于生物功能材料的應用單一以及口腔炎癥和細菌微環(huán)境的存在，目前臨床上廣泛應用的牙周骨再生材料或技術(shù)難以實(shí)現牙槽骨再生。南方醫科大學(xué)口腔醫院于光濤等人聯(lián)合深圳灣實(shí)驗室饒浪教授課題組設計開(kāi)發(fā)了一種3D打印生物墨水用于牙周炎源性骨缺損修復，該生物墨水由EPLGMA為主體并裝載干細胞和細胞囊泡用于發(fā)揮抗菌抗炎促成骨功能。相關(guān)研究成果以題為“3D-printed bioink loading with stem cells and cellular vesicles for periodontitis-derived bone defect repair"的文章發(fā)表在《Biofabrication》上。南方醫科大學(xué)口腔醫院博士研究生趙瑜越、深圳灣實(shí)驗室博士后朱文祥為第一作者，南方醫科大學(xué)口腔醫院于光濤、容明燈、麻丹丹和深圳灣實(shí)驗室饒浪教授為共同通訊作者。



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圖1. 仿生3D打印墨水的制備工藝及其對牙周炎源性骨缺損的生物學(xué)作用示意圖



作者首先通過(guò)摩方精密microArch® S230（精度：2 μm）打印了以EPLGMA為主體的仿生模板，結合模板法和光引發(fā)聚合合成了EPLGMA@PDLSCs@MDCSs-MV(EPM)。具體步驟如下：首先，將GMA緩慢滴入EPL溶液中，得到EPLGMA，在藍光(405 nm)照射后轉化為交聯(lián)水凝膠。然后，將乳牙牙周膜的PDLSCs和MDSCs膜囊泡(MDSCs- MV)加入EPLGMA中形成溶液生物墨水。通過(guò)掃描電鏡觀(guān)察凍干生物墨水的微觀(guān)結構，我們可以清楚地看到網(wǎng)狀多孔結構，這有利于促進(jìn)PDLSCs的增殖、遷移和營(yíng)養物質(zhì)或代謝物的運輸，從而發(fā)揮作用（圖2）。

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圖2. EPLGMA的特點(diǎn)。(a) EPLGMA制備工藝示意圖。(b) EPLGMA狀態(tài):藍光照射前(左)和照射后(右)。(c)凍干EPLGMA的掃描電鏡。(d) EPL和EPLGMA的1H NMR譜。(e) EPLGMA的時(shí)間掃描流變分析。(f) EPLGMA的粘度。(g) EPLGMA的壓應力-應變曲線(xiàn)。



隨后，作者探究了仿生墨水的3D打印性能。作者利用Solidworks軟件建立三維CAD模型，通過(guò)對于不同結構的模型進(jìn)行打印，證明仿生墨水打印出的結構在大尺寸上仍能夠保持一定的精準度。隨后作者用激光共聚焦顯微鏡對打印形狀內的細胞進(jìn)行顯色觀(guān)察，結果顯示細胞在3D打印仿生墨水中的形態(tài)下分布均勻，并且保持良好的活力（圖3）。表明了EPM是一種高效、可行、個(gè)性化的打印生物墨水。

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圖3. 3D打印系統對EPLMA生物墨水進(jìn)行個(gè)性化3D打印。



為了驗證EPL天然的抗菌潛力，作者將生物墨水與牙齦卟啉單胞菌共培養兩個(gè)小時(shí)，并將其涂布到血平板上進(jìn)行觀(guān)察。24小時(shí)后可見(jiàn)EPM組表現出良好的抗菌效果（圖4）。

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圖4. EPM的抗菌性能。(a) EPM抗菌功能示意圖。(b) PBS(對照)和EPM處理2 h后的牙齦卟啉單胞菌(P.g)的血平板培養照片。(c)不同組牙齦卟啉單胞菌數量的定量評價(jià)。(d) PBS(對照)和EPM處理后的牙齦卟啉單胞菌活/死染色。



控制炎癥是牙周炎治療過(guò)程中重要步驟。作者利用MDSCs在抗炎中發(fā)揮的作用，首先從荷瘤小鼠體內收集MDSCs，并提取MDSCs-MV，然后采用蛋白圖譜分析了MDSCs-MV的蛋白組成。通過(guò)KEGG通路分析，結合免疫熒光實(shí)驗結果，作者表明MDSCs-MV可以通過(guò)CD39/CD73-腺苷信號通路靶向抑制微環(huán)境中的T細胞從而發(fā)揮抗炎功能（圖5）。

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圖5. MDSCs-MV的抗炎特性(a) MDSCs-MV生物學(xué)功能示意圖。(b) Western blot檢測MDSCs和MDSCs- mv的特征性膜蛋白標志物。(c) MDSCs-MV孵育后T細胞的代表性共聚焦圖像。(d) CD3和MDSCs-MV熒光強度線(xiàn)掃描。(e)流式細胞術(shù)定量T細胞MDSCs-MV的熒光強度。(f) Elisa法檢測轉染MDSCs-MV或不轉染MDSCs-MV后T細胞分泌腺苷的情況。(g)經(jīng)MDSCs-MV或不經(jīng)MDSCs-MV孵育后CD4+ T細胞CFSE稀釋的典型流式細胞術(shù)圖。(h)不同組CD4+ T細胞CFSE稀釋度的定量分析。(i) CD8+ T細胞加或不加MDSCs-MV孵育后CFSE稀釋后的典型流式細胞術(shù)圖。(j)不同組CD8+ T細胞CFSE稀釋度的定量分析。



最后，為了評估3D生物墨水的成骨能力，作者構建了SD大鼠頜骨骨缺損模型，并同期模擬炎癥狀態(tài)，然后根據骨缺損的面積以及深度，打印出合適的形狀并進(jìn)行了驗證。經(jīng)過(guò)3個(gè)月的治療后，通過(guò)Mirco-CT以及免疫熒光實(shí)驗結果，EPM@Pg組展示出了最佳的抗菌、抗炎以及促成骨效果（圖6）。

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圖6. EPM的體內骨再生效果。(a)生物墨水治療人工牙周炎骨缺損小鼠模型的實(shí)驗設計。(b)用不同生物墨水完成的3d打印。(c)生物墨水治療牙周炎骨缺損的手術(shù)過(guò)程圖片。(d)術(shù)后2、3個(gè)月不同治療組下頜骨缺損區具有代表性的三維Micro-CT圖像。(e) - (i) BV (f)、BV/TV (f)、Tb.N (g)和Tb.Th(h)的定量分析。



結論：作者利用EPLGMA加載PDLSCs和MDSCs-MV，制作了一種新型的、可定制的多功能3D打印模塊，用于治療牙周炎源性骨缺損。該EPM材料繼承了EPL的天然抗菌特性，可以有效地殺滅牙周病細菌，并且在抗炎方面，其中的MDSCs-MV通過(guò)CD73/CD39/腺苷信號通路抑制T細胞?？傊?，EPM支架表現出良好的抗菌、抗炎和骨再生效果。與傳統骨粉填充材料相比，3D打印仿生墨水材料具有更加優(yōu)異的生物性能。